朗伯比尔定律(朗伯比尔定律的公式及符号含义)

分光光度法是指利用分光光度计的分析方法，具有灵敏、准确、快速、选择性好的特点。

通常被测样品溶液浓度下限可达10-6~10-5mol/L，适用于食品中微量成分(如肉制品中的亚硫酸盐、糖果中的二氧化硫等)的测定。).

一.原则

1.1物质对光的选择性吸收当光束照射到物质上时，光与物质相互作用，产生反射、散射、吸收或透射。如果被照射的溶液是均匀的，光的散射可以忽略。1.1.1溶液颜色的产生当一束白光通过有色溶液时，一部分波长的光被溶液吸收，另一部分通过溶液。透射或反射的光线刺激人眼使人感受到颜色的存在。人能感觉到的光定义为可见光。在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜色，因此溶液的颜色由透射光的波长决定。透射的光和吸收的光可以形成白光，所以叫做互补色，两种颜色是互补色。

1.1.2光吸收的本质当一束光照射物质或其溶液时，组成物质的分子、原子或离子与光子“碰撞”，光子的能量转移到分子、原子或离子上。正是这些粒子从最低能态(基态)跃迁到较高能态(激发态)。这种作用叫做物质对光的吸收。受激粒子在大约10-8s后返回基态，并以热或荧光的形式释放能量。分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，只有当被照射光子的能量hυ等于被照射物质粒子基态和激发态的能量之差时，才能发生吸收。不同的物质粒子由于结构不同，量子化能级不同，基态和激发态的能量差也不同。所以物质对光的吸收是有选择性的。

1.1.3吸收曲线吸收曲线又称吸收光谱，描述了一种物质对不同波长的光的吸收能力。不同波长的光透过固定浓度和厚度的有色溶液，测量有色溶液在每个波长的吸收程度(即吸光度)。然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，画出的曲线就是吸收曲线。对于不同浓度的同一物质，吸收峰附近的吸光度随着浓度的增加而增加，但最大吸收波长不变。如果在最大吸收波长处测量吸光度，则灵敏度最高。因此，吸收曲线是分光光度法中选择测定波长的重要依据。

1.2光吸收的基本定律，即朗伯-比尔定律:当平行单色光通过液层厚度为B的有色溶液时，溶质吸收光能，光强会减弱。溶液浓度越大，液层厚度越大，入射光越强，光被吸收越多，光强减弱越明显。这一规律是紫外-可见分光光度法和其他吸收分光光度法定量分析的基础。它是通过实验观察得到的，不仅适用于溶液，也适用于其他均匀的、非散射的吸光物质。

A=lg(I/I0)=εbc

A-吸光度；

0-入射光强度，CD；

I-透射光强度，CD；

ε-吸收系数，l/(mol÷cm)；

——液层厚度(光程长度)，厘米；

c——有色溶液的浓度，mol/L..其物理意义是，当一束平行的单色光通过单一均匀无散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。其中ε是吸光物质在特定波长和溶剂下的特征常数，数值上等于吸光物质在1cm光路中浓度为1mol/L时的吸光度。

ε是吸光物质吸光能力的量度。ε值越大，方法的灵敏度越高。从实验结果计算ε时，经常用被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，实际上就是表观摩尔吸收系数。在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，则体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度是相加的。透射率t是透射光强度I与入射光强度I0的比值，即:

T=I/I0因此:A=lg(1/T)

二。主要部件虽然光度计的种类很多，但都是由相同的基本部件组成，包括光源、单色仪、吸收池和检测系统。

2.1测量吸光度时，要求光源发出所需波长范围内的连续光谱，该光谱应具有足够的光强，并在一定时间内保持稳定。在可见光区测量时，通常使用钨灯作为光源。钨丝加热到白炽状态，会发出波长在320 ~ 2500nm之间的连续光谱。钨灯的工作温度一般为2600~2870K，熔点为3680K K，钨灯的温度取决于电源电压，电源电压的微小波动都会引起钨灯强度的巨大变化，所以必须使用稳压电源。在紫外区测量时，常用氢灯或氘灯产生波长在180 ~ 375nm之间的连续光谱作为光源。其理想的光源应具有覆盖整个紫外-可见光区的连续辐射，且强度应相对较高，能量随波长变化不大，但实际上很难实现。氘灯的辐射强度比氢灯高2~3倍，寿命更长。氙灯的强度一般比氢灯高，但不稳定。波长范围为180~1000nm，常用作荧光分光光度计的激发光源。

2.2单色仪单色仪是将光源发出的复合光分解成单色光的装置。一般由五部分组成:入射狭缝、准光气(一般用透镜或凹面镜将入射光制成平行光束)、色散器、投影仪(一般用透镜或凹面镜将分出的单色光投射到出射狭缝)、出射狭缝。色散器件是单色仪的核心部分，常用的色散元件是棱镜或光栅。棱镜是由玻璃或应时制成的。玻璃棱镜的色散能力很强，但是会吸收紫外光。它只能用于波长350-820nm的分析和测定。在紫外区，必须使用应时棱镜。光栅的特点是色散均匀、线性、测光容易自动化、工作频带宽。

2.3吸收池(Absorption cell)，又称比色杯，是盛放样品溶液的容器，两个平面相互平行，透明，厚度精确。一般玻璃吸收池的光程长度为1cm，但也有0.1-10cm的。因为吸收池的厚度存在一定的误差，其材料对光并不完全透明。做定量分析时，吸收池要做匹配试验，试验后要标注放置方向。紫外区的值没有跳到应时。

2.4检测系统检测系统包括检测器和记录显示装置。探测器是一种光电转换器件，将光强转换成电信号并显示出来。常用的检测器包括光电池、光电倍增管和光电二极管阵列检测器。光电池光电流大，不需要放大。用于初级分光光度计时，疲劳效应严重。光电倍增管利用二次电子发射放大光电流，放大倍数可高达108倍，应用最广。光电二极管阵列探测器可以在0.1s内扫描190-800nm的波长范围，因为所有波长同时被检测，扫描速度快。记录装置包括放大器和结果显示装置。

20世纪70年代采用数字读出装置。现代主机配有微处理器或外部微型计算机，控制仪器的操作和处理测量数据，并配有屏幕显示器、打印机和绘图仪。

三。测定条件的选择3.1显色反应及显色条件的选择进行比色或光度分析时，应先将待测组分转化为有色化合物，再进行比色或光度测定。将待测组分转化为有色化合物的反应称为显色反应，与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。

3.1.1颜色反应的选择颜色反应分为络合反应和氧化还原反应两种，络合反应是最重要的颜色反应。选择原则是:

1)选择敏感的颜色反应。摩尔吸光系数ε是显色反应灵敏度的重要标志，因此应选择生成的有色物质ε较大的显色反应。一般来说，当ε为104-105时，可以认为该反应的灵敏度较高。

2)尽可能选择选择性好的显色剂。也就是说，显影剂只与一种组分或几种组分反应。

3)显色剂在测量波长处无明显吸收。通常两种有色物质的最大吸收波长之差称为反差，一般要求显色剂与有色化合物的反差在60nm以上。

4)反应生成的有色化合物成分恒定，化学性质稳定。

3.1.2显色条件的选择吸收分光光度法测定显色反应达到平衡后溶液的吸光度。因此，为了得到准确的结果，有必要研究平衡，了解影响显色反应的因素，并控制适当的条件，使显色反应完全而稳定。

1)根据溶液平衡原理，显色络合物的稳定常数越大，显色剂越过量，越有利于待测组分形成显色络合物。但过量显色剂的加入有时会导致副反应，不利于测定。

2)酸度对显色反应有多种影响。通过实验确定了金属离子与某种显色剂反应的适宜酸度范围。测定方法是固定待测组分和显色剂的浓度，改变溶液的pH值，测定其吸光度，做出吸光度-pH值曲线，选择曲线平坦部分对应的pH值作为测定条件。

3)显色反应一般在室温下进行，有些反应需要加热，以加快显色反应，使其完全。

4)大部分显色反应需要一定时间才能完成，其长短与温度有关。还会被空气体氧化或发生光化学反应使眼睛颜色变弱。因此，有必要通过实验做出一定温度下吸光度-时间关系曲线，以获得合适的显色时间。

干扰的消除

1)干扰的类型在光度分析中，共存离子如自身颜色或与显色剂相互作用生成有色化合物，都会对测定产生干扰。

A.干扰离子本身有颜色。

B.干扰离子本身没有颜色，但能与显色剂反应形成稳定的络合物。如果生成的络合物有颜色，会直接干扰测定；如果生成的络合物无色，也会降低显色剂的浓度，影响被测离子与显色剂的反应，产生误差。

C.干扰离子与被测离子反应生成络合物或沉淀，影响被测离子的测定。

2)消除干扰的方法a .控制溶液的酸度。b、加入掩蔽剂，与干扰离子形成更稳定的化合物，使干扰离子不再产生干扰。c .用参比溶液消除一些有色干扰离子的影响。选择合适的工作波长以消除干扰。e .采用适当的分离方法。

3.2吸光度测量条件的选择

3.2.1应根据吸收光谱曲线选择入射光的波长，选择溶液有最大吸收时的波长作为入射光的波长。例如，显色剂和钴络合物在420nm波长处具有最大吸收峰。如果在该波长下测定钴，未反应的显色剂会造成干扰并降低测定的准确度。因此，必须选择500纳米的波长，在该波长下显影剂不吸收。钴络合物有一个吸收平台。

3.2.2对照溶液的选择1)如果只有供试品与显色剂的反应产物有吸收，可使用纯溶剂作为对照溶液。2)若显色剂或其他试剂有轻微吸收，则使用空白色溶液(无样品溶液)作为对照溶液。

3)如果样品中的其他成分被吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂未被吸收时，样品溶液可作为对照溶液。当显色剂被轻微吸收后，在加入显色剂前，可在供试品溶液中加入适当的掩蔽剂掩蔽待测组分，此溶液可作为对照溶液。

3.2.3选择吸光度读数范围的实践证明，当吸光度在0.2-0.5范围内时，测量的相对误差最小。调节被测溶液吸光度的方法有两种:1)控制被测溶液的浓度。例如改变取样量、改变溶液的浓度或稀释度。2)选择不同的比色皿。吸光度小的溶液应使用光程长的比色皿，吸光度大的溶液应使用光程短的比色皿。四。应用

4.1应用领域

4.1.1高含量组分的测定-差示法当待测组分含量较高时，测得的吸光度值往往偏离朗伯-比尔定律。即使没有偏差，通常也是用纯溶剂作为参比溶液(常见的光度法)，这样测得的吸光度过高，超过了合适的读数范围，导致误差较大。这个缺点可以用微分法来克服。但应用差示法时，要求仪器光源有足够的发射强度或能增加光电流放大倍数，这样才能将参比溶液的透过率调整到100%。这就要求单色仪质量高，光电系统稳定性好。

4.1.2多组分分析使用紫外-可见分光光度法，通常可以在不分离的情况下测定同一样品溶液中的多种组分。假设溶液中同时存在两个组分X和Y，它们的吸收光谱一般有重叠和不重叠的情况。不重叠的确定成分不会相互干扰。如果吸收光谱重叠，则分别在λ1和λ2处测量吸光度A1和A2。从吸光度值的相加获得联立方程，并且通过解联立方程获得浓度值。

4.2定量方法紫外-可见分光光度法分析的定量基础是光吸收定律，但具体操作方法有很多。

4.2.1标准曲线法，即工作曲线法，适用于大量重复样品分析，是工厂控制分析中应用最广泛的方法。根据光吸收定律，ε是有色化合物的常数值。如果光程L也是固定的，那么吸光度A与溶液的浓度C成正比，也就是说吸光度A与浓度C成线性关系，配制一系列适当浓度的标准溶液，显色后测定其吸光度，将吸光度A对浓度C作图，得到工作曲线。

直接比较法

直接比较法的本质也是工作曲线法，是一种简化的工作曲线法。将一个标准样品与已知浓度的被测组分cs匹配，测得其吸光度为，然后在相同条件下测得未知样品的吸光度为Ax，计算出未知样品的浓度cx。

As=εcsL

Ax=εcxL

因为溶液性质相同，比色皿厚度相同，所以/Ax=cs/cx公式:

cs——已知被测组分的浓度，mol/L；

Cx-未知样品的浓度，mol/L；

被测成分的已知吸光度；

Ax-未知样品的吸光度。直接比较法简化了绘制工作曲线的步骤，适用于单个样品的测定。操作时，应注意配制的标准样品的浓度要接近被测样品的浓度，这样可以减少测量误差。

4.2.3标准加入法标准加入法是工作曲线的特殊应用。选择合适的显色条件，先以浓度cx为Ax测定未知样品的吸光度，然后在未知样品中加入一定量的标准样品，配制成浓度cx+δ C1，CX+δ C2 ……的系列样品，显色后，测定吸光度为A1，A2……最后在坐标纸上，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，分别画出δ C1和δ C2对应的A1和δ C2。应用标准加入法时，应注意加入的标准样品浓度要合适，以使绘制的曲线保持在合适的角度。浓度过大或过小都会造成测量误差。该方法操作麻烦，不适用于系列样品分析，但适用于成分复杂、干扰因素多的样品，因为它可以消除背景的影响。

4.3紫外-可见分光光度计的使用注意事项4.3.1保护光源。光源灯有一定的寿命。仪器不工作时不要开灯。如果间歇时间很短，不要关灯。机器停止后，待灯冷却后重新启动，预热15分钟。当灯泡发黑或亮度明显减弱或不稳定时，要及时更换。紫外线照射后形成结痕可以用无水乙醇去除。

4.3.2保证合适的工作环境温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。不适当的温度和湿度会引起机械部件的腐蚀，降低金属镜面的光洁度，引起仪器机械部件的误差或性能下降；造成光栅、反射镜、聚焦镜等光学元件铝膜腐蚀，造成光能不足、杂散光、噪声等。甚至使仪器停止工作，从而影响仪器的寿命。维护期间，应定期校正温度和湿度。实验室，尤其是位于中国南方的实验室，应具有四季恒温的仪器室，配备恒温设备。环境中的灰尘和腐蚀性气体也会影响机械系统的灵活性，降低各种限位开关、按键和光电耦合器的可靠性，也是光学元件铝膜腐蚀的原因之一。所以一定要定期清洗，保证仪器内的环境和卫生条件，防止灰尘。

4.3.3仪器经过一定时间的定期除尘和校准后，内部会积累一定量的灰尘。最好由维修工程师或在工程师的指导下定期打开仪表盖进行除尘。同时重新紧固各发热元件的散热器，清洁光学箱的密封窗口，必要时校准光路，清洁润滑机械部分，最后恢复原状，然后做一些必要的测试、校准和记录。

4.3.4正确使用比色皿取比色皿时，手指只能握住比色皿的磨砂玻璃面，不要触摸比色皿的透明面，以免污染。清洁比色皿时，先用水清洗，然后用蒸馏水清洗。如果比色杯被有机物污染，可在盐酸-乙醇混合洗涤液(1:2)中浸泡一会儿，然后用水冲洗。每次实验后立即清洗比色皿。用镜纸或柔软吸水纸吸干比色皿外壁的水，保护透光面。测量有色溶液的吸光度时，一定要用有色溶液冲洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。在测量一系列溶液的吸光度时，通常按照从稀到浓的顺序进行测量，以减少测量误差。如果分光光度计有噪音，可能是光源灯泡使用寿命超过了使用寿命，可以更换光源灯泡。如果自检时提示波长自检错误，可能是自检时仪器样品室的盖子已经打开，可以关闭仪器样品室的盖子进行自检。