荧光定量pcr技术是干什么的(荧光定量PCR技术是什么)

原文:何琪博士

审核:广州中医药大学第一附属医院王海滨教授。

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一.基本原则

PCR使用待扩增的DNA分子作为模板，一对与模板互补的寡核苷酸片段作为引物。在DNA聚合酶的作用下，它按照半保守复制的机制沿着模板链延伸，直到新DNA的合成完成。重复扩增可以扩增目标DNA片段。因为新合成的DNA也可以作为模板，所以合成量呈指数增长。

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

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实验步骤:

I .样品RNA的提取

预先离心预冷4。

1.细胞溶解或组织匀浆。a .贴壁细胞吸走培养基，6孔板的每个孔中有1ml trizol，12孔板中有0.5 ml。b .悬浮细胞离心收集细胞，吸干液体，每500万-1000万个动植物或酵母细胞或1000万个细菌加入1毫升trizol。用枪或适当的旋涡吹，确保完全破裂。如果有些酵母菌和细菌没有完全裂解，可以用均质机进行均质，保证充分裂解。c .将组织切成小块并磨碎。每50mg-80mg组织加入1ml trizol，裂解20min。在对RNA完整性要求高的情况下，组织要用液氮保存。2.室温下吹裂5min。3.在每毫升Trizol中加入200ul氯仿，涡旋混合或上下剧烈摇动15-30s，室温静置3 min，4℃离心15min，吸取上层含总RNA的无色水相至新的离心管中，约350ul(每毫升Trizol可吸取约0.5-0.55ml)。5.向每毫升初始Trizol中加入500微升异丙醇，吹动并混合均匀，并在室温下静置10分钟。6.4℃离心12000g 10min，弃去上清液，(用枪从EP管口吸出废液)，管底可见RNA沉淀。7.向每毫升初始Trizol中加入1毫升75%无水乙醇(用DEPC水稀释),不吹气。8.4℃离心7500g 5min，弃去上清液，从喷嘴吸出液体并用200ul枪头盖好，用带泵盖的白色小枪头吸出EP管内残留水滴。每个样品都需要更换枪头。)倒放在卫生纸上，静置5min。[或用离心机摇动(> 5,000rpm，离心1秒)，小心吸干液体]

二、RNA质量检测

1.紫外吸收法测定

首先，使用稀释的TE溶液将分光光度计调零。然后用TE (1:100)稀释少量RNA溶液，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，确定RNA溶液的浓度和纯度。

(1)纯度检测:RNA溶液的A260/A280比值即为RNA纯度，比值范围为1.8-2.1。

三、样品cDNA的合成

1.反应系统:一般按照购买的试剂盒的操作步骤执行。

2.向混合溶液中加入逆转录酶前，70℃干浴3分钟，取出后立即在冰水浴中取出，直至管内外温度一致，再加入0.5 μl逆转录酶，在37℃水浴中取出60分钟。

3.取出后立即用95℃干浴3分钟，得到最终的逆转录液，即cDNA溶液，保存于-80℃备用。

4.梯度稀释标准品和待测样品的β-肌动蛋白实时定量PCR。

1.反应系统如下:参考使用的试剂盒。

2.将制备好的阳性标准品和供试品同时放入电脑，反应条件为:93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。