质粒图谱怎么看(质粒图谱为什么有两个方向)

质粒是基因工程中常用的载体，也是生物实验的基本要素。正确阅读质粒图谱是实验的第一步。对于实验小白，这篇文章教你如何快速破译质粒图谱。

首先，熟悉你感兴趣的质粒。

让我们从一个经典的质粒pBR322开始，它经常被用作衍生载体的骨架，因为它具有成功克隆所需的所有特征。从图的中心可以看出，线性化质粒的大小为4361个碱基对。在开始处理任何质粒之前，建议用一种独特的限制酶将其线性化，以检查大小是否与预期大致相同。

黑色箭头表示转录方向，这是克隆所必需的。如果你在另一个基因中间克隆你的目标基因，请确保两个基因的转录方向一致。否则，本地启动子会干扰你的基因表达。

“Ori”是什么意思？

在基因序列数据库如Entrez-PubMed中，质粒序列是从线性序列形式的ori序列中提取的。“Ori”是指质粒复制的起点，不可改变。质粒一旦不能复制，就没用了。

关于ori需要记住的另一件事是同源质粒通常是不相容的。这意味着你将无法在一个细胞中维持两个pBR323衍生的载体，即使它们具有不同的抗生素抗性基因。Pb322ori也用于pUC18，真核载体中第二常见的主干。

在哪里可以找到限制性位点？

相应酶的限制性位点由起始核苷酸位置的垂直线表示。这些位置应该是唯一的，但是值得检查一下，因为派生的向量通常包含额外的被遗忘的序列。

关于抗生素抗性基因

PBR322有两个抗性基因:tet(四环素抗性)和amp(氨苄青霉素抗性)。这些基因编码外排泵(tetR)和β-内酰胺酶(ampR ),分别从细胞中分泌四环素和氨苄青霉素。Tet和amp从不同的方向读取。

记住，β-内酰胺酶对青霉素类抗生素的解毒没有特异性。所以即使你有两个复制起点不同的质粒，如果一个表达甲氧西林耐药基因，一个表达氨苄青霉素耐药基因，你也不能同时选择两个质粒。

当使用限制性内切酶位点将目标基因克隆到质粒中时，要注意哪些位点属于你的抗生素抗性基因。比如BamHI在TetR中间消化。众所周知，基因的破坏会导致基因功能的失活——在这种情况下就是抗生素耐药性。

如何开始和停止复制？

除了基因，质粒通常包含来自大肠杆菌噬菌体的转录启动子和终止子。噬菌体SP6和T7的启动子通常用于体外RNA扩增。它们需要噬菌体聚合酶，所以在体内没有活性。

下图为非洲爪蟾卵母细胞表达载体pTLNX的表达图谱。除了常见的pBR322 ori和抗生素抗性基因AmpR和CmR(氯霉素抗性)外，还有SP6和lacUV启动子。在SP6启动子的下游，rrnBT2终止子允许克隆到多克隆位点的基因被有效终止。

pTLNX载体还具有质粒选择基因(ccdB)、病毒SV40核定位信号和非洲爪蟾球蛋白3’UTR，这允许克隆基因的高表达。

质粒总是在进化的，所以最好使用已知的图谱资源库，如Addgene、Entrez-PubMed等。，以免忽略一些“不重要”的特性，而这些特性可能对你的实验至关重要。

来源:每日生物评论

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