基因表达载体包括什么?(基因表达载体包括什么细胞)

根据Coherent Market Insights的估计，全球基因细胞治疗市场将从2017年的60亿美元增长到2026年的350亿美元，年复合增长率为22%。自1990年第一次临床试验成功以来，基因治疗经历了近30年“乐观与热情——失望与怀疑——理性与挑战”的认知过程，近5年来迅速崛起。在今年的Pharmaprojects年度报告中，正在研究的基因疗法数量达到了1589种。

基因疗法数目在近5年来出现爆发式增长 图片来源：The Pharma R&D Annual Review 2021（Pharma projects）近五年来，基因疗法的数量激增。图片来源:制药R&D年度回顾2021(制药项目)

[br/]基因疗法

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿异常和缺陷基因引起的疾病，从而达到治疗目的。基因治疗原理简单，但过程涉及复杂的基因设计和靶细胞有效表达的递送机制[1]。目前，上市产品和临床研究药物的成功，美国食品药品监督管理局(FDA)逐渐简化的方法，以及投资机构和投资者的兴趣，正在鼓励和引导基因疗法治疗甚至治愈更多的遗传疾病[2]。

基因治疗最早的热潮始于1990年。与需要频繁输注的生物蛋白产品不同，基因治疗产品可以直接将基因输送到细胞中进行连续传代，以保证核酸内切酶或其他蛋白质的持续产生[5]。因此，它最初被设计为一种治疗遗传疾病根源而不仅仅是缓解其症状的技术，因此它主要专注于癌症、肿瘤和遗传疾病等重大疑难杂症[1，4]。但由于前期对载体、靶细胞和疾病性质认识不足的局限，大部分试验并没有产生治疗效果，有的甚至导致了不良事件。

1999年，患有鸟氨酸转氨酶缺乏症的18岁男孩杰西·格尔辛格(Jesse Gelsinger)在接受腺病毒基因治疗的临床试验后出现严重的免疫反应并死亡，这也是首例因基因治疗而死亡的病例。在这一点上，科学家更加重视基因传递技术等基础科学的研究。

20世纪90年代末21世纪初以来，第二代临床研究对靶细胞有了更深入的认识，同时产生了新的技术。例如，2003年10月，中国美国食品药品监督管理局(CFDA)批准了全球首个基因治疗产品——Gendicine(现生生)用于治疗头颈部鳞状细胞癌，Gendicine由腺病毒5型携带。2009年，宾夕法尼亚大学利用AAV载体成功治愈了先天性黑变病(LCA)患者。这些研究还证实，将更有效的基因递送至靶组织将产生临床益处[3]。

最近，FDA停止了辉瑞公司一种新的AAV基因治疗药物PF-06939926的Ib期临床试验，该药物用于治疗杜氏肌营养不良症(DMD)。虽然FDA已经批准了许多AAV的基因治疗药物，但AAV在基础科学研究、临床试验和商业化方面取得了巨大成功。然而，临床病人死亡的连续发生也提醒我们，AAV病媒也面临着安全问题。

在过去的30年中，我们发现这项技术受到了低效基因转移和与免疫原性和毒性相关的不良事件的阻碍[1-3]。在这方面，基因转移可能是一个实质性的障碍，限制了疗效并引起并发症，因此探索合适的基因递送载体一直是基因治疗发展的关键因素。

基因治疗递送载体

在开发合适的载体时，需要考虑几个标准:

(1)待包装的DNA和基因的总大小；

(2)基因表达效率；

(3)治疗时间；

(4)免疫反应；

(5)生产；

(6)整合到细胞DNA中；；

(7)患者可能感染病毒的风险。

目前，用于基因治疗的载体通常分为病毒或非病毒载体。

病毒主要包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体等。由于其高递送效率、组织特异性和插入宿主基因组，它们被广泛用于药物研究和开发。大约70%的细胞和基因治疗临床试验使用病毒载体。根据Pharma projects的年度报告，腺相关病毒(AAV)载体仍然是基因治疗中最常见的病毒载体，并且它已经广泛用于临床前和临床开发阶段。腺病毒次之。除了这两种病毒载体，还研究了其他病毒载体类型，包括慢病毒、单纯疱疹病毒和弹状病毒。

逆转录病毒:它是开发的第一种病毒载体。逆转录病毒是一种正链RNA病毒，它可以在受感染的细胞中逆转录，产生互补的DNA链。互补DNA随机整合到宿主细胞的基因组中，并能长期稳定表达。基因治疗中，包装的外源基因只能小于8kb，所以只适用于体外细胞感染。

慢病毒:在HIV-1基础上发展起来的基因治疗载体，具有感染谱广、能有效感染有丝分裂和静止期细胞、外源基因能长期稳定表达等优点。现在，慢病毒系统已经广泛应用于基因过表达、RNA干扰、microRNA研究和各种细胞系的活体动物实验。

腺病毒:腺病毒是一种双链无包膜、非整合的DNA病毒。这类病毒载体没有包膜，不易被其补体灭活，相对安全，因此在体内基因传递方面具有很大优势。同时，腺病毒不能在分裂旺盛的细胞内长时间表达目的基因，多次感染会导致免疫反应增强，从而影响基因表达和基因治疗。

腺病毒:是一种复制缺陷型单链DNA病毒，需要腺病毒的帮助参与生命周期，使外源基因定点整合到宿主细胞的染色体中。现在，改良的AAV载体不需要腺病毒的帮助，不插入到宿主基因组中，而是游离于卫星状态的宿主细胞的基因，并长期稳定表达。目前，AAV的研究包括蛋白质替代疗法、基因编辑、基因沉默等。

非病毒载体主要是纳米载体和聚合物载体，具有操作简单、成本低、免疫原性低等特点。近年来，该技术平台发展迅速，未来有望降低细胞和基因治疗药物的开发成本。

此外，以簇间隔规则的短回文重复序列/相关Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)为代表的基因编辑技术近年来发展迅速，并于2020年获得诺贝尔化学奖。基因编辑技术可以通过核酸酶精确修饰特定的靶基因，并已应用于临床研究。

目前大部分基因细胞治疗项目都采用病毒作为载体，因此使用什么样的病毒载体能够安全有效地传递基因仍然是业界关心的问题。同时，基因细胞治疗的商业化痛点也是病毒载体的生产成本。据悉，已上市的Kymriah和Yescarta的病毒载体制备费用几乎占总费用的三分之一。病毒载体的大规模生产(提高产量和产量)需要从培养体系、质粒转染、纯化和回收等方面进一步优化，既能降低细胞和基因治疗的成本，又能加快药物的放量。

同时，基因治疗的不可逆性迫使监管部门对病毒载体的纯度和浓度有严格的要求。病毒载体的生产过程复杂，即使经过多步纯化，DNA良好的稳定性也使其在生产过程中容易形成残留。与残留DNA相关的潜在危害包括传染性、致瘤性和免疫原性，因此核酸残基的去除也是病毒载体生产中必不可少的环节。

UniversalBenzo核酸酶可以高效降解任何形式的核酸序列，最终将核酸完全消化成长度为2-5个碱基的5&#39。-单磷酸寡核苷酸，因此广泛用于生物制品的加工或纯化。同时配套的全能核酸酶定量检测试剂盒可以准确检测样品中残留的核酸酶，保证病毒载体的纯度和安全性。使用Novozen万能核酸酶和核酸酶定量检测试剂盒，在提高病毒载体纯化质量的同时，可以有效监控杂质污染的风险，为基因治疗产品的规模化生产提供有力保障。

产品列表

[参考文献]

[1]汉娜·伊夫等人& # 34；基因治疗的发展:缓慢的进展和光明的前景.."市场准入与健康政策杂志5.1(2017)

[2]辛西娅·邓巴等人。基因疗法成熟了。"科学359.6372(2018)

[3]尼恩胡斯·阿瑟·W等人的& # 34；造血细胞中逆转录病毒整合的遗传毒性.."分子治疗:美国基因治疗学会杂志13.6(2006)

[4]侯赛因·S·R等人癌症基因治疗:审批的监管考虑.."癌症基因治疗22.12(2015年)

[5]库马尔、S. R .等人。基因治疗的临床发展:近期成功的结果和教训。"分子治疗-方法与临床发展3(2016)