甲苯胺蓝染色(甲苯胺蓝染色软骨细胞)

8月19日，国际自噬领域核心期刊《自噬》在线发表了题为《Mir505-3p通过调控Atg12和自噬途径影响神经元轴突发育》的研究论文。该研究由东华大学化学生物学院荀团队和中国科学院上海生命科学院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心邱子龙研究组合作完成。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建Mir505基因敲除小鼠，通过靶向自噬相关基因Atg12，负性调节自噬途径，促进神经元轴突发育，报道了Mir505-3p基因的新功能。该研究为自噬对神经发育的调控提供了新的证据。

“自噬”意为“自噬”，是一种包裹、降解和回收体内衰老细胞器和包浆内容物的生理方式。自噬最明显的特点是需要合成一种多层膜结构，称为“自噬体”。在这种膜结构的包裹和呈递下，包涵体进入溶酶体系统并被降解。虽然自20世纪70年代以来，神经元是最早观察和鉴定自噬超微结构的细胞之一，但自噬如何影响神经系统的发育、神经退行性疾病的发生以及损伤后如何调节轴突的再生等方面缺乏详细的研究。近年来，神经系统细胞自噬的基础和临床研究以及自噬途径关键基因的动物模型研究已成为医学和神经系统疾病相关领域的重要课题。

周宇荀团队在前期研究中发现了一个与小鼠性发育相关的数量性状位点(图A)，并发现Mir505基因是一个潜在的调控因子。另一项关于人类X染色体连锁垂体发育不良的研究表明，Mir505也位于调节疾病的数量性状位点(图B)。由于哺乳动物性发育和脑垂体发育的本质是神经系统的发育，东华大学的研究人员试图研究Mir505基因是否影响神经系统中的神经发育事件，并由此与中国科学院神经科学研究所邱子龙研究组开展了项目合作。

首先，研究人员使用体外培养的皮质神经元模型来验证Mir505基因是否参与调节神经元发育。发现Mir505基因的成熟体Mir505-3p特异性地促进神经元极性的建立、轴突生长和轴突分支，但不影响树突的发育。另一个Mir505基因的成熟体没有这种功能。研究人员通过胚胎电迁移技术在小鼠皮质中观察到了相同的表型。利用双荧光素酶报告系统，结合生物信息学预测和神经元转录组测序数据，研究人员从神经元中筛选出Mir505-3p的靶基因为自噬相关基因Atg12。Atg12是细胞自噬途径中的关键基因，其编码的ATG12蛋白分子与ATG5蛋白和ATG16L1蛋白形成复合物，调控自噬体的早期形成和延伸。在这项研究之前，尚不清楚Atg12是否参与调节神经系统发育事件。

为了研究Atg12对神经元形态发育的作用，研究人员分别通过脂质体转染和电穿孔在体外培养的小鼠皮层神经元中过表达Mir505-3p和Atg12。发现Atg12显著抑制神经元极性的建立、轴突生长和轴突分支，这与Mir505-3p表现出的功能相反。此外，Mir505-3p的共转化可以恢复Atg12对神经元轴突发育的抑制作用(图C)，初步证实了Atg12在体外抑制神经元轴突发育的现象。利用胚胎电转运技术，研究人员观察到Atg12的过量表达可以恢复Mir505-3p对同侧皮层和对侧皮层神经元轴突生长和分支的促进作用(图D)，进一步证实了Atg12在体内抑制神经元轴突发育的现象。

为了进一步研究Mir505-3p是否是小鼠神经元轴突发育所必需的，研究人员利用CRISPR/Cas9系统构建了特异性敲除Mir505基因的基因工程小鼠。通过HE染色、甲苯胺蓝染色(图E)和免疫荧光染色(图G)，研究人员观察到Mir505基因敲除小鼠的胼胝体、扣带皮层和海马等轴突富集区的信号下降，但扣带皮层的成熟神经元数量没有明显变化(图G)。提示Mir505基因敲除小鼠轴突信号降低的原因不是神经元前体细胞的增殖受到干扰，而是Mir505-3p对小鼠轴突的正常发育是必需的。利用这种小鼠模型，研究人员在透射电镜下观察到，在Mir505基因敲除小鼠体外培养的小鼠皮质神经元和皮质组织中，自噬体发生了显著变化(图F)。基因敲除小鼠的自噬体数量和面积显著增加，而线粒体数量显著减少。这表明Mir505-3p是维持神经系统正常自噬信号所必需的，敲除Mir505基因导致神经系统中整个自噬通路被激活。研究表明，轴突的发育涉及细胞微管系统中细胞骨架蛋白的重排，膜蛋白和许多极性蛋白分子的合成和运输，这些都依赖于神经元足够的能量供应。因此，轴突的局部线粒体分布和线粒体流动性对于轴突的生长和分支非常重要。Mir505基因敲除小鼠神经元胞体和轴突中局部自噬体数量增加，线粒体数量减少，进一步提示Mir505-3p最终通过自噬途径调节轴突中局部线粒体的分布，从而影响神经元轴突的发育。研究人员在MEF细胞的原代培养中证实，Mir505-3p可以通过抑制Atg12来影响自噬途径和线粒体的数量。

本工作利用体外神经元培养模型、体内胚胎电转运技术、电子显微镜技术和基因工程小鼠模型，鉴定了Mir505-3p调控神经元轴突发育的表型。据报道，Mir505-3p在神经系统中的靶基因是自噬相关基因Atg12，这突出了microRNA和自噬在神经元轴突发育中的关键作用。提出了Mir505-3p通过调控Atg12/自噬途径影响轴突局部线粒体分布的全新信号通路及其分子机制(图H)，对于更深入了解自噬途径对神经系统发育的调控具有重要意义。

这项工作是由东华大学博士生、现中国科学院神经科学研究所博士后在荀和邱子龙的共同指导下完成的。邱子龙研究组的其他成员余斌、程成、程天林、积极参与其中，得到了组内张、单世芳以及神经所的共聚焦显微镜平台、向丹、陈，干细胞平台、钱、姜伟芳和animal的技术支持。科技部973项目、国家基金委重大研究计划培育项目、中科院战略性先导科技项目、国家自然科学基金、上海市科委重点项目、东华研究生创新基金等项目支持。

注:(A)Mir505基因位于调节雌性大鼠性发育的数量性状基因座。(B)Mir505基因位于影响人类X染色体连锁垂体发育不良的数量性状基因座中。(c)在体外培养的小鼠皮质神经元中，Mir505-3p通过抑制Atg12来调节神经元极性的建立、轴突生长和轴突分支。(d)体内胚胎电转运结果显示Mir505-3p通过抑制Atg12促进对侧脑室皮质神经元的轴突生长和轴突分支。(e)甲苯胺蓝染色显示Mir505敲除小鼠胼胝体的异常轴突发育。(f)透射电镜结果显示Mir505基因敲除小鼠大脑皮层组织中自噬体的数量和面积增加，线粒体数量减少。图F中，绿色假色表示自噬体，蓝色假色表示线粒体。(g)免疫荧光染色显示Mir505基因敲除小鼠的胼胝体、扣带皮层和海马中的轴突发育异常，但扣带皮层中成熟神经元的数量正常。H)Mir505-3p通过Atg12/自噬途径调节神经元轴突发育的机制。