高效液相色谱仪原理(气相色谱仪价格)

文/剑君

全文3470字，建议阅读13分钟。

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，对样品的应用和适用性非常广泛。它不受分析对象的挥发性和热稳定性的限制。几乎所有的化合物，包括高沸点、极性、离子化合物和大分子物质，都可以用高效液相色谱进行分析测定，从而弥补了气相色谱的不足。在已知的有机化合物中，大约20%可以用气相色谱分析，而80%需要用高效液相色谱分析。HPLC具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度好的特点，可以分析分离沸点高、不可气化的热不稳定生理活性物质。它已成为分离分析技术在化学、医学、工业、农业、商检和法医检验中的重要应用。

-一...

基本原理

色谱的分离原理是:溶解在流动相中的组分通过固定相时，由于与固定相相互作用(吸附、分配、排斥、亲和)的大小和强度不同，在固定相中的保留时间也不同，所以它们相继从固定相中流出。也称为色谱法和色谱法。

高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上，以液体为流动相，采用高压灌注系统。将不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液和其他流动相泵入装有微粒极细的高效固定相的色谱柱中。柱内组分分离后，进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析。

图1.高效液相色谱仪分析流程图一。高效液相色谱分析流程

-二-

系统组成

HPLC系统一般由输液泵、注射器、色谱柱、检测器、数据记录和处理装置等组成。输液泵、色谱柱和检测器是关键部件。另外还有梯度洗脱装置、在线脱气器、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等。也可以根据需要进行配置。现代HPLC仪器还具有微机控制系统，用于自动仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪器还配备有自动馏分收集装置。

图2.高效液相色谱仪的系统组成图二。高效液相色谱仪的系统组成

1.输液泵是高效液相色谱系统中最重要的部件之一。输液泵按恒定输出分为恒压泵和恒流泵，泵的性能直接影响整个系统的质量和分析结果的可靠性。

根据工作模式，输液泵可分为气动泵和机械泵。机械中有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复隔膜泵。

表1.几种高压性能泵的性能比较表1。几种高压性能泵的性能比较

HPLC使用的输液泵应满足以下条件:

①流速稳定，其RSD应< 0.5%，这对定性定量分析的准确性至关重要；

②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100ml/min；；③输出压力高，一般应达到150 ~ 300kg/cm2；

④液压缸体积小；

⑤良好的密封性能和耐腐蚀性能。

(1)往复式柱塞泵

当活塞向外移动时，泵头出口止回阀关闭，而流动相入口止回阀打开，溶液(流动相)被泵入活塞缸。当柱塞推入筒内时，入口止回阀关闭，出口止回阀打开，流动相被压出活塞筒，流向色谱柱。双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。它的优点是不需要用阻尼器来消除脉动，从而避免了阻尼器的压力消耗，但缺点是设备成本较高，流量调节较单柱塞泵复杂。往复式活塞泵的特点是连续供应恒定体积的流动相，而不受色谱系统其余部分的阻力的微小变化的影响。

图3.单活塞往复式柱塞泵的构造（A）和双活塞往复式柱塞泵构造（a）及排液特性（b）图3。单活塞往复活塞泵的结构(A)和双活塞往复活塞泵的结构(A)和排水特性(B)

(2)隔膜往复泵

隔膜往复泵也是一种恒流量泵。当活塞与油接触时，隔膜受到油压的影响，产生流动相& # 34；吸引& # 34；或者& # 34；推& # 34；，使得流动相部分的单向阀吸入或排出液体，从而获得稳定的液体流动。隔膜泵的活塞不与流动相直接接触，因此不存在活塞垫圈磨损造成的流动相污染。隔膜泵死体积小(约0.1mL)，更换流动相后平衡快，有利于梯度洗脱。然而，隔膜泵结构复杂，价格昂贵。

图4.隔膜型往复泵结构示意图4.隔膜往复泵结构示意图

(3)气动放大泵

气动放大泵是一种恒压泵。泵头通常由两部分组成——止回阀和密封圈——柱塞杆。通常，止回阀由一个阀体\塑料\或陶瓷阀座和一个红宝石球组成。在压力作用下，红宝石球离开阀座，流动相流经止回阀；反之，在反向力的作用下，宝石球返回阀座，流动相不再流经止回阀。

2.脱气装置

流动的溶液经常由于溶解氧或与空气体混合而形成气泡。当气泡进入检测器时，色谱图上会出现尖锐的噪声峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱时流动相流速变慢或变得不稳定，导致基线波动。一旦气泡进入色谱柱，排出它们需要时间。在荧光检测中，溶解氧也会淬灭荧光。溶解的气体也可能导致一些样品氧化或改变溶液的pH值。

目前液相色谱流动相脱气广泛采用离线超声振荡脱气、在线惰性气体鼓泡脱气和在线true 空脱气。

超声波脱气:将准备好的流动容器放入超声波水槽中脱气10-20分钟。这种方法简单，基本能满足日常分析的要求，所以目前仍被广泛使用。

惰性气体气泡吹扫脱气:将气源(钢瓶)中的气体(氦气)缓慢均匀地引入储液槽中的流动相中，其他气体分子被氦气分子所取代，但其在溶剂中的溶解度很小，微量氦气形成的小气泡对检测没有影响。

True 空脱气器:流动相通过一段由多孔合成树脂膜制成的输液管，输液管外有一个true 空容器。true 空泵工作时，膜的外部被减压，小分子量的氧气、氮气和二氧化碳会从内部进入膜的外部并被除去。

图5.真空在线脱气装置示意图图5。real 空在线除气器示意图

3.梯度洗脱装置HPLC有两种方式:等度洗脱和梯度洗脱。等体积洗脱是指在同一分析周期内流动相的组成保持不变，适用于组分少、性质差异小的样品。梯度洗脱是为了在一个分析周期中控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值。它用于分析具有多种成分和不同性质的复杂样品。梯度洗脱可以缩短分析时间，改善分离度、峰形和检测灵敏度，但它往往会引起基线漂移，降低重现性。两种溶剂组成的梯度洗脱可以任意程度混合，即有多种洗脱曲线:线性梯度、凹形梯度、凸形梯度、阶梯式梯度。线性梯度是最常用的方法，特别适合在反相柱上进行梯度洗脱。

线性梯度： 在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。阶梯梯度： 直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。

梯度洗脱有两种实现方式:低压梯度(外梯度)和高压梯度(内梯度)。

高压梯度一般只用于二元梯度，即两个高压泵按照设定的比例分别向混合器输送两种流动相A和B。它具有精度高、易于实现自动控制的优点。

图6.高压梯度装置结构示意图图6。高压梯度装置结构图

低压差只需要一个高压泵。与等度洗脱输注系统相比，在泵的前面安装了一个比例阀，混合在比例阀中完成。常压混合时容易形成气泡，所以通常在在线脱气器中设置低压梯度。

图7.四元低压系统结构示意图图7。第四系低压系统结构图

4.在进样系统的早期，使用膜片和停流进样器，安装在色谱柱的入口处。现在大多使用六通注射阀或自动注射器。取样装置要求:密封性好，死体积小，重复性好，保证集中取样，取样时对色谱系统的压力和流量影响小。

一般来说，六通进样阀是HPLC分析中常用的进样阀，六通进样阀的进样方式有两种:部分进样法和完全进样法。

①注射用部分充液法:注射量应不超过定量环体积的50%(最多75%)，每次注射的体积应准确、相同。这种方法的准确性和重复性依赖于注射器进样的熟练程度，且容易产生注射引起的峰增宽。

②注射用完全充液法:注射量应不少于定量环体积的5~10倍(至少3倍)，以完全取代定量环中的流动相，消除壁效应，保证注射的准确性和重复性。

图8.六通进样阀构造原理示意图图8。六通喷射阀结构原理示意图

5.分离系统分离系统包括色谱柱、保护柱和柱温箱。

色谱柱:色谱是分离分析的手段，分离是核心，所以负责分离的色谱柱是色谱系统的心脏。色谱柱由柱管、压盖、套圈(密封圈)、筛板(过滤器)、接头、螺钉等组成。色谱填料是经过制备和处理后用于填充色谱柱的物质颗粒，通常为粒径为5-10的球形颗粒。色谱柱根据用途可分为分析型和制备型，其尺寸和规格也各不相同:

①常规分析柱(常量柱)，内径2~5mm(国内常见4.6mm、4mm、5mm)，柱长10 ~ 30cm；

②窄孔(也称小直径半微柱或半微柱)，内径1~2mm，柱长10 ~ 20cm；

③内径0.2 ~ 0.5 mm的毛细管柱(也称微柱)；

④内径> > 5mm的半成品柱；；

⑤在实验室准备柱子，内径20~40mm，长10 ~ 30cm；

⑥生产制备柱:内径可达几十厘米。

图9.色谱柱结构示意图图9。色谱柱结构示意图

保护柱:保护柱的作用主要是防止吸附性强的杂质污染色谱柱，从而延长色谱柱的使用寿命。对于不同类型的色谱柱，应选择相应填料的保护柱。需要注意的是，柱芯也是有寿命的，要定期更换。

柱温箱:保持柱温恒定，避免保留时间的变化，保证分离效果的稳定。

6.检测器

检测器是用来连续监测色谱柱分离出的流出液的组成和含量变化的装置，是高效液相色谱仪器的三大关键部件之一。HPLC检测器要求灵敏度高、噪音低(即对温度、流速等外界变化不敏感)、线性范围宽、重复性好、应用范围广。

表2.HPLC常用检测器的基本特性表二。常用的基本特征2。高效液相色谱检测器

7.数据处理系统该系统能够收集、存储、显示、打印和处理测试数据，以便正确地进行样品的分离、制备或鉴定。