微克每毫升(微克每毫升换算成百分含量)

吴铜仁市检验所554300

本文研究了固相萃取、浓缩和净化-气相色谱法测定牛奶和乳饮料中的C18H34O2(游离脂肪酸)。脂肪酸经石油醚-乙醚萃取(第一种方法)和叔丁基甲醚-正己烷萃取(第二种方法)提取，经固相萃取柱进一步净化，用氢氧化钾和甲醇酯化，气相色谱-氢火焰离子化检测器(FID)测定。

结果表明，峰面积与浓度在0.01 ~ 0.04毫克/毫升范围内呈良好的线性关系，r >: 0.999。在0.005、0.01和0.02mg/mL添加水平下，第一种方法的平均回收率为87.20% ~ 107.10%，相对标准偏差为2.22 ~ 4.00。第二种方法的平均回收率为85.6% ~ 97.1%，相对标准偏差为2.38 ~ 5.00，略低于第一种方法。结果表明，这两种方法适用于乳饮料中游离脂肪酸的测定，具有快速、准确、灵敏的优点。

1.材料和方法

1.1实验材料和试剂

仪器和设备

安捷伦科技公司的气相色谱仪(配有FID检测器)；旋转蒸发器RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂；电热恒温水浴，上海跃进医疗器械有限公司；DSY- II型自动选矿机，北京金科京华源技术研究所。

试剂

乙酸、石油醚、乙醇、无水硫酸钠、乙醚、石油醚、氯化钠、氢氧化钾(国药化学试剂有限公司)；正己烷、三氟化硼甲醇、二氯甲烷、异丙醇、叔丁基甲醚、甲醇(美国TEDIA技术公司)。

1.2实验操作和步骤

1.2.1样品脂肪提取的准备

(1)用石油醚C4H10O提取脂肪的方法

牛奶、酸奶等液体样品:称取10g(精确至0.1mg)样品放入吸脂管中进行检测。

奶酪和奶粉的固体样品:称取1.0g(精确至0.1 mg)样品于吸脂管中，加入10mL 65±1℃的水溶解样品，摇匀使样品完全分散。

向上述样品中加入2 mL氨水，置于65±1℃水浴中15min，取出，轻轻摇匀，冷却至室温。向准备好的样品中加入10mLC2H6O，并充分混合。加入25 mLC4H10O，塞住并摇动1分钟。加入25mL石油醚，加入塞子，摇匀1分钟，静置，分层，将有机层转移至烧瓶中。加入25mLC4H10O和25mL石油醚，加入塞子，摇匀1min，静置分层，将有机层转移至烧瓶中，再次重复上述操作。在底烧瓶中合并提取物，并通过旋转蒸发器浓缩至干。

(2)用叔丁基甲基醚和正己烷提取脂肪的方法

称取牛奶、酸奶等液体样品10g(精确至0.01mg)，置于50mL离心管中，加入10mLC2H6O和1mLH2SO4(2.5mol/L)。

奶酪:称取1g(精确至0.01mg)奶酪，用无水Na2SO4粉碎，加入0.3mLH2SO4(2.5mol/L)。

奶粉:称取1g(精确至0.01 mg)奶粉，加入10ml 65±1°C的水溶解样品，摇匀使样品完全分散，加入10mLC2H6O和1mL H2SO4(2.5mol/L)。

分析步骤

(1)浓度

在60℃水浴条件下，旋转蒸发至近干，然后在60℃下用氮气干燥。

(2)收集游离的C18H34O2

过氨基柱

活化:加入3毫升二氯甲烷异丙醇(2:1)和3毫升叔丁基甲基醚(1:1)活化色谱柱。

装样:向样品中加入3mL叔丁基甲醚和正己烷(1:1)并摇匀，溶解样品并吸入柱中。

洗脱:加入6mL二氯甲烷异丙醇(2:1)(重复两次)洗脱结合的C18H34O2。

收集:用3毫升2%的乙酸叔丁酯甲酯洗脱(重复两次)，用圆底磨瓶收集，使游离的C18H34O2洗脱。

用旋转蒸发器干燥。

(3)皂化和酯化

干燥后，加入10 mL氢氧化钾甲醇溶液，置于80±1℃水浴中回流10 min。然后加入5 mL三氟化硼甲醇溶液，继续回流15分钟，冷却至室温。

(4)样品注射

取出，静置冷却，倒入50mL离心管中，用饱和氯化钠溶液冲洗瓶中残渣，每次3mL，共4次。用移液管吸取10mL正己烷到离心管中，盖上试管，混合均匀，并以5000rpm离心5min。离心后，取上层有机相2mL，置于样品瓶中进行气相色谱分析。

1.2.3仪器参数和测量条件

色谱条件:

色谱柱:SP-2560(聚二氰丙基硅氧烷，强极性固定)，柱长100米，内径0.25毫米，膜厚0.20微米

载气:氮气。气体流速:1.0毫升/分钟。

样品入口温度:260℃..分割比例:30:1。

检测器温度:280°c

柱温箱温度:初始温度为140 ℃,保持5±5分钟，以4 ℃/ min的速度升温至240 ℃,保持15分钟。

1.2.4气相的定性和定量分析

外标法定量分析。根据测得的样品溶液中游离C18H34O2的含量，选择浓度相近的标准工作溶液。标准溶液和待测溶液中游离C18H34O2的响应值均在仪器的线性范围内。将标准工作溶液和待测溶液等体积注入样品中进行测定。将待测样品的峰值直接与标准样品的峰值进行比较，计算出样品含量。

样品中游离C18H34O2的含量按公式(1)计算

类型:

as——样品溶液中游离C18H34O2的峰面积；

astd——标准工作溶液中游离C18H34O2的峰面积；

CSTD——标准工作溶液中游离C18H34O2的浓度，单位为微克每毫升(mg/mL)；

V ——样品溶解或浓缩后的定容体积，单位为毫升(mL)；m——样品的称量值，单位为克(g)；

f—校正系数。

标准曲线的绘制

因为牛奶中肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸的含量分别为8% ~ 14%、22% ~ 35%和9% ~ 14%，所以三种C18H34O2可以占到C18H34O2总量的60%以上。

用正己烷配制肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的标准系列，含量分别为0.010、0.015、0.020、0.0275和0.04mg/mL，在规定的色谱条件下进行测定。在优化的气相色谱分析条件下，注入20μL样品，按式(2)计算，以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

根据公式(1)计算工作曲线的回归方程:

Y=m C+b (2)

类型:

Y -C18H34O2的峰面积；C -C18H34O2浓度，mg/mL；m线性回归方程的斜率。b-线性回归方程的截距；1.2.6精密度实验中，所有样品均为10g，按照优化后的GC分析条件进行测定。同一天进样6次，记录峰面积值，计算标准偏差和相对标准偏差，考察其重现性。

回收率实验

为了评估方法的准确性，样品分别用肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)以0.005、0.01和0.02mg3的三个浓度进行添加和回收。每个样品取4个样品，一个作为样品的背景，其余加入不同浓度的标准工作液。

2.结果和讨论

2.1预处理方法的选择

2.1.1选择萃取剂

采用石油醚C4H10O萃取法和叔丁基甲基醚正己烷萃取法。第一种方法是用氨水破坏脂质和非脂质成分的结合，然后用石油醚萃取。

C4H10O沸点低，溶脂能力比石油醚强。现有的脂肪含量标准分析方法都使用C4H10O作为萃取剂。但C4H10O能饱和2%左右的水，非脂成分如糖也会从含水的C4H10O中提取出来。因此，在实际操作中必须使用无水C4H10O作为萃取剂，并且被测样品必须预先干燥。石油醚沸点高，不凝胶溶解，不会携带胶体淀粉、蛋白质等物质。石油醚提取物接近真实脂质。

第二种方法是硫酸-—C2H6O破坏脂质和非脂质成分的结合，然后用叔丁基甲醚-正己烷萃取。由于样品中乳脂中的脂肪球被牛奶中的酪蛋白钙包裹，处于高度分散的胶体分散体系中，不能被提取剂直接提取，需要用碱或酸处理后再提取。

2.1.2净化方法的选择

在游离C18H34O2的收集中，本文使用了过氨基(NH2)小柱，它具有极性固定相和弱阴离子交换剂，可以通过弱阴离子交换(水溶液)或极性吸附(非极性有机溶液)保留，因此适用于水溶液中碳水化合物和有机酸化合物的弱阴离子。实验表明，该方法具有溶剂用量少、操作简单、游离C18H34O2洗脱效果好等优点。

2.2检测限和线性范围

从整体数据来看，第一种方法中棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的回收率比较理想，平均比第二种方法高5 ~ 10%左右。通过石油醚C4H10O的连续萃取，可以很好的萃取出C18H34O2。对于第二种方法中肉豆蔻酸(C14:0)的测定，

2.3采用两种前处理方法测定不同乳饮料中游离C18H34O2的含量。

从市场上选取了四种常见的乳饮料(牛奶、酸奶、奶酪和奶粉)。对四种不同含乳饮料中游离C18H34O2进行了检测，并对不同含乳饮料中游离C18H34O2的含量和组成以及两种方法的检测结果进行了讨论。

2.3.1用石油醚C4H10O提取脂肪的方法

第一种方法对四种不同的乳饮料进行预处理、纯化和甲基化。最后气相色谱结果显示，奶酪中游离的C18H34O2最多为105.13 mg/100g，其次是奶粉和牛奶，酸奶中游离的C18H34O2至少为1.78mg/100g。

一般液态奶的脂肪含量为3 ~ 5%，奶粉不低于26%，奶酪不低于25%，而酸奶的脂肪含量约为0.5 ~ 1.2%。

在技术上，酸奶发酵后降解了部分脂肪和蛋白质。乳酸菌发酵乳糖产生乳酸菌时，pH值降低，延长了产品的保存时间。

奶粉经喷雾干燥后，可采用两级均质法降低游离C18H34O2的含量。

奶酪是以蛋白质和脂肪为主要成分，含有少量无机盐、乳糖和维生素的乳饮料。100份原料奶大概只能生产10份奶酪，也就是说原料的主要成分蛋白质和脂肪浓缩了10倍。长期发酵也会产生更多的游离C18H34O2。

牛奶中游离C18H34O2的组成和比例分别为:肉豆蔻酸(C14:0)7%，棕榈酸(C16:0)47%，硬脂酸(C18:0)19%，其他27%。

牛奶样品中游离C18H34O2的组成和比例为:肉豆蔻酸(C14:0)4%，棕榈酸(C16:0)30%，硬脂酸(C18:0)10%，其他56%。

干酪中游离C18H34O2的组成和比例分别为:肉豆蔻酸(C14:0)5%，棕榈酸(C16:0)36%，硬脂酸(C18:0)16%，其他43%。

奶粉中游离C18H34O2的组成和比例分别为肉豆蔻酸(C14:0)4%，棕榈酸(C16:0)41%，硬脂酸(C18:0)14%，其他41%。

根据以上数据，在各种游离C18H34O2中，棕榈酸(C16:0)占总游离C18H34O2的40 ~ 60%，其次是硬脂酸(C18:0)，约占10 ~ 20%。相比较而言，肉豆蔻酸(C14:0)的含量最低。

棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)和肉豆蔻酸(C14:0)的总含量可达总游离脂肪的50~90%。可以说乳饮料中游离的C18H34O2占了很大比例。

同时可以看出，牛奶中的游离脂肪种类并不多，其中以棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、肉豆蔻酸(C14:0)为主。

当然也有可能牛奶中肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸的含量分别为8% ~ 14%、22% ~ 35%、9% ~ 14%，三种C18H34O2可占C18H34O2总量的60%以上。所以游离C18H34O2中三种成分的量也占了大部分。

奶酪与牛奶色谱图相比,多了 C18:1N9C(油酸)和 C18:2N6C( 亚油酸 ),各游离酸明显增多。与牛奶色谱图相比，C18:1N9C(油酸)和C18:2N6C(亚油酸)增多，游离酸明显增加。

2.3.2叔丁基甲醚-正己烷脂肪提取法第二种方法对四种不同的乳饮料进行预处理、净化、甲基化，最后用气相色谱仪测定。结果如表1所示。该方法得到的结果略小于石油醚C4H10O萃取得到的结果。

采用两种前处理方法对同一品牌的同一商品进行测定。相比较而言，用石油醚C4H10O萃取的样品中测得的数据略大于用叔丁基甲醚和正己烷萃取的样品中测得的数据，相差约10% ~ 20%。

从表3中还可以发现，四种乳饮料中游离C18H34O2的含量由低到高有明显差异。从两种方法结果的比较也可以看出，对于牛奶、酸奶、奶酪、奶粉中游离C18H34O2的测定，第一种方法明显高于第二种方法。因此，无论游离C18H34O2样品的多少，第一种方法的结果都略高于第二种方法。

第一种方法用氨水-C2H6O溶液破坏牛奶的胶体和脂肪球膜，使非脂肪成分溶解在氨水-C2H6O溶液中，释放出脂肪，再用C4 h10 o—-石油醚提取脂肪，效率更高。第二种方法用硫酸-C2H6O溶液水解，然后通过几次离心用叔丁基甲醚和正己烷萃取。

第一种方法是用石油醚C4H10O多次连续提取，用振动法提取。经过几次连续提取，脂肪可以更好的溶解在石油醚C4H10O中。在实验操作中，由于C4H10O比石油醚具有更强的溶脂能力，所以在第一次萃取时，最好将C4H10O放在石油醚之前。

3.结论

本文研究了含有游离脂肪酸的乳和乳制品的预处理方法，包括石油醚和乙醚萃取法和叔丁基甲醚和正己烷萃取法。石油醚-乙醚萃取法(第一种方法)是用氨-乙醇破坏脂类和非脂类成分的结合，然后用石油醚-乙醚进行萃取。叔丁基甲醚和正己烷的萃取方法(第二种方法)是硫酸-乙醇破坏脂类和非脂类成分的结合，然后用叔丁基甲醚和正己烷进行萃取。通过实验发现，第一种方法比第二种方法提取的游离脂肪酸多。

在两种前处理方法的线性和回收率实验中可以得出，在0.01mg/mL-0.04mg/mL的浓度范围内，峰面积与浓度有良好的线性关系，r >；0.999。在0.005、0.01和0.02 mg/mL添加水平下，第一种方法的平均回收率为87.20%-107.10%，相对标准偏差为2.22-4.00，而第二种方法的平均回收率为85.6%- 97.1%，相对标准偏差为2.38-5.00，略低于第一种方法。

综上所述，两种方法均适用于乳制品中游离脂肪酸的测定，具有快速、定量准确、检测灵敏的优点。相比较而言，石油醚和乙醚萃取法的回收率略高。

参考资料:

[1]常玲玲。中国荷斯坦牛乳中脂肪酸的变化及其与脂肪酸合成相关基因的关联分析[D]。扬州大学，2011。

[2]孙·。放牧奶牛乳脂肪酸组成及瘤胃脂肪酸代谢的研究[D].西北A&F大学，2012年。

[3]、龚、、郑育才、杨明、许、刘志猛、杜、金粟裕。气相色谱-质谱法分析德昌水牛奶的脂肪酸组成[J].食品研究与发展，2008(01):123-125。

[4]林仲礼、张金玲、蔡子健、姜明峰、刘一力、蒋卫华。泌乳期牦牛乳中脂肪酸变化的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2015(07):5-8。

俞峰，，陆。牦牛乳脂肪酸结构和功能特性分析[J].中国食品科学，2006(01):311-315。