怎么看懂液相色谱图(HPLC图谱分析)

一.基本原则

高效液相色谱(HPLC)是一种柱色谱分离技术，使用高压下的液体作为流动相，使用极细颗粒的高效固定相。

高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象的挥发性和热稳定性的限制，弥补了气相色谱的不足。在已知的有机化合物中，大约20%可以用气相色谱分析，而80%需要用高效液相色谱分析。

高效液相色谱和气相色谱在基础理论上没有明显区别。它们之间的主要区别在于作为流动相的液体和气体的性质不同。

二、高效液相色谱分析的原理

(1)高效液相色谱分析过程:

储液瓶中的溶剂被泵吸入色谱系统，然后输出。测量流量和压力后，将其引入注射器。被测物质由进样器注入，通过装有流动相的色谱柱，在柱上分离后进入检测器。检测信号由数据处理设备采集和处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。

在复杂混合物分离的情况下(宽极性范围)，梯度控制器也可用于梯度洗脱。这类似于气相色谱的程序升温，只不过气相色谱改变的是温度，而HPLC改变的是流动相的极性，使样品的组分在最佳条件下得到分离。

(2)高效液相色谱的分离过程:

与其他色谱过程一样，HPLC是固定相和流动相之间溶质的连续交换过程。它是利用两相之间的分配系数、亲和力、吸附力或分子大小的差异所造成的排斥差异来分离不同的溶质。

样品最初应用于色谱柱头。假设样品含有A、B、C三种组分，与流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相捕集，较早流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上停留时间长，稍后流出色谱柱。组分B的分配系数在A和C之间，第二组分流出柱外。如果含有多种组分的混合物进入系统，混合物中的组分会根据它们在两相之间的不同分配系数流出色谱柱，从而达到分离的目的。

色谱过程中不同组分的分离取决于两相之间是否存在分配系数、吸附容量和亲和力的差异，这是一个热力学平衡问题，也是分离的首要条件。

其次，当不同组分在色谱柱中移动时，谱带随柱长变宽，分离与两相之间的扩散系数、固定相的粒径、色谱柱的填料和流动相的流速有关。因此，分离的最终效果是热力学和动力学的综合效益。

三。工作原理

储液器中的流动相由高压泵泵入系统，样品溶液通过注射器进入流动相，由流动相加载到色谱柱(固定相)中。由于样品溶液中的组分在两相中具有不同的分配系数，当它们在两相中相对移动时，经过反复的吸附-解吸分配过程，组分的移动速度差别很大，组分被分离成单个组分依次流出柱外。当通过检测器时，样品浓度被转换成电信号进行传输。

四。高效液相色谱的特点和优势

高效液相色谱具有以下特点:

高压——压力可达150~300公斤/平方厘米。色谱柱每米压降大于75 Kg/cm2。

高速-流速为0.1~10.0毫升/分钟。

高效率-每米高达5000个托盘。一根色谱柱可以同时分离多达100种成分。

高灵敏度——紫外检测器的灵敏度可以达到0.01ng，同时消耗的样品更少。

与经典液相色谱相比，高效液相色谱具有以下优点:

快速——通常分析一个样品需要15 ~ 30分钟，有的样品甚至可以在5分钟内完成。

高分离度-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

高灵敏度——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。

色谱柱可以重复使用，不同的化合物可以通过一根色谱柱分离。

样品体积小，易于回收——样品通过色谱柱后不会被破坏，可以采集或制备单一组分。

液相色谱的五个系统

1.样品注入系统

喷射系统分为手动喷射阀和自动喷射器。

手动注射阀

对于手动进样阀，需要注意的是，每次进样后都要清洗进样阀，防止残留影响下次样品分析。

还需要注意注射方式。以20μL定量环为例，我们可以选择完全填充定量管或部分填充定量管。为了保证注射的重复性，在选择完全充满定量管的注射方法时，需要注射三倍以上定量环体积的注射液。当选择部分填充定量管时，进样体积应小于定量管体积的一半，即1-10μ l

自动取样器

如果用自动进样器进样，首先要保证注射器内没有气泡，否则会影响进样量的准确性；其次，样品瓶里有足够的样品，保证注射针能吸到样品。

为了避免交叉污染，有必要定期清洁样品瓶、瓶盖和垫。如果长时间不使用自动进样器，需要注意的是，腐蚀性的流动相或洗涤液(如碱性或酸性缓冲溶液)必须从系统中彻底更换。同时，为了避免细菌的生长，应在样品瓶中装满甲醇，并重复几次注射操作。

2.输液系统

输液泵根据输出量的恒定分为恒压泵和恒流泵。对于液相色谱分析，输液泵的流量稳定性更为重要，因为流量的变化会引起溶质保留值的变化，而保留值是色谱表征的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更加广泛。

根据工作模式，输液泵可分为气动泵和机械泵。机械中还有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复隔膜泵。

高效液相色谱使用的高压泵应满足以下条件:

流量恒定，无脉动，调节范围大(一般1 ~ 10ml/min)；

b能抗溶剂腐蚀；

c具有高注入压力；对于一般分离，60×105Pa的压力就足够了，对于高效分离，要求达到150 ~ 300× 105 Pa。

(1)往复式活塞泵的结构和原理

当柱塞被推入圆筒时，泵头出口处的单向阀(上部)打开，而流动相进入的单向阀(下部)关闭，然后输出少量流体。

相反，当向外拉动柱塞时，流动相入口处的单向阀打开，同时出口处的单向阀关闭，一定量的流动相被其收集器吸入圆筒。

这种泵的特点是它能连续供应恒定体积的流动相，而不受整个色谱系统其余部分的阻力的微小变化的影响。

(2)气动放大泵的结构和原理

其工作原理是:当压力为p1的低压气体推动大面积(SA)活塞A时，小面积(SB)活塞B输出压力增加到p2的液体。压力增加的倍数取决于活塞A和B的面积比，如果A和B的面积比为50: 1，压力为5×105Pa的气体可以得到压力为250×105Pa的输出液体。这是一个恒压泵。

泵头通常由两部分组成——止回阀和密封圈——柱塞杆。通常，止回阀由阀体、塑料或陶瓷阀座和红宝石球组成。在压力作用下，宝石球离开阀座，流动相流经止回阀；反之，在反向力的作用下，宝石球返回阀座，流动相不再流经止回阀。

显然，宝石球和阀座之间的配合必须非常合适，以防止流动相的泄漏。为了保证止回阀不泄漏，有些止回阀装有两套宝石球和阀座，有些止回阀用合适的弹簧将宝石球压在阀座上。

在不同的应用领域，止回阀阀体的材料是不同的。例如，考虑到生物相容性系统，止回阀阀体通常由钛而不是不锈钢制成。为了降低成本和维护费用，有些厂家还采用了可更换的卡扣式塑料单元，当然其功能保持不变。

输注系统是指高压恒流泵，其功能是提供稳定准确的流速。

溶剂过滤头:液体吸收过滤头或沉淀器，主要用于过滤流动相中可能存在的颗粒杂质。长期使用后，杂质可能会堵塞溶剂过滤头上过滤板的小孔；或者缓冲液使用时间较长，容易在过滤头表面形成薄膜，阻碍流动相的正常通过。

严重时，即使溶剂已经过超声波，抽吸时四氟乙烯输液管内也会产生气泡，所以要经常清洗过滤头。清洗溶剂可以是乙醇或30%稀硝酸溶液，正相系统要注意滤头的干燥处理。

单向阀:单向阀的作用是保证液体向一个方向流动，是高压恒流泵稳定输注的保证。日常使用中，我们可以通过观察压力来初步判断流量是否正常。

如果系统已经平衡了一段时间，压力应该是稳定的。但如果压力波动，流量不稳定；如果没有压力，就没有流动。在这两种情况下，气泡或杂质混合在止回阀中。

如果有气泡，打开阀门空并按下冲洗键排出气泡。如果止回阀混有杂质，必须清洗。清洗溶剂可以选择乙醇，安装时要注意标记环的方向。

密封圈:密封圈固定在柱塞杆上，防止泵腔内的液体泄漏，是保证泵头正常输液的关键部件。但柱塞杆和柱塞密封圈在长期使用后会有磨损，主要与流量、工作压力和使用的流量有关。

使用含盐的流动相时，由于脱水或蒸发可能会形成盐结晶，盐结晶会造成泵运动时密封圈和柱塞杆的磨损。因此，每天实验前后都要用纯水清洗密封圈(柱塞密封圈和二次密封圈之间)，清洗管内要留有水，防止结晶形成，从而延长柱塞杆和密封圈的使用寿命。

在线过滤器:为了防止杂质颗粒由于流动相进入色谱系统，泵在排出空阀中装有在线过滤器。从泵出口流出的液体通过在线过滤器，但从排放空管流出的液体不通过在线过滤器。

使用仪器一段时间后，建议用户清洁在线过滤器的烧结不锈钢过滤片。用扳手拆下压盖，取出密封环和烧结不锈钢过滤器进行清洗，清洗后装回原位。清洗溶剂可选用30%稀硝酸溶液，正相系统应注意滤头的干燥处理。

3.分离系统

分离系统包括色谱柱、保护柱和柱温箱。

色谱柱:色谱柱是样品分离的核心。使用色谱柱前，必须仔细阅读说明书，了解色谱柱的pH值范围、溶剂耐受范围、压力范围和维护方法。色谱柱用完后，要及时清洗。清洗后应将色谱柱从仪器上拆下，两端用厂家提供的塞子密封，存放在色谱柱箱内。

保护柱:保护柱的作用主要是防止吸附性强的杂质污染色谱柱，从而延长色谱柱的使用寿命。对于不同类型的色谱柱，应选择相应填料的保护柱。需要注意的是，柱芯也是有寿命的，要定期更换。

柱温箱:柱温的变化可能导致保留时间的变化。为了避免这个问题，建议使用柱温箱。

4.探测系统

高效液相色谱常用的检测器有三种:紫外检测器、折光率检测器和荧光检测器。

(1)紫外线检测器

该检测器适用于检测紫外(或可见光)吸收样品。其特点是应用广泛(如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等。)，灵敏度高(检测下限为10-10g/ml)，线性范围宽，对温度和流速变化不敏感，可以检测用梯度溶液洗脱的样品。

(2)差示折射检测器

折射率不同于流动相的任何样品组分都可以用示差折光检测器检测。目前，该检测系统主要用于碳水化合物的检测。该系统通用性强，操作简单，但灵敏度低(检出限为10-7g/ml)。流动相的变化会引起折光率的变化，因此不适合痕量分析或梯度洗脱样品检测。

③荧光检测器

在一定条件下，任何具有荧光的物质的发射光的荧光强度与该物质的浓度成正比。因此，这种检测器只适用于测定带有荧光的有机化合物(如多环芳烃、氨基酸、胺、维生素和某些蛋白质等)。)，而且其灵敏度很高(检出限为10-12 ~ 10-14g/ml)。痕量分析和梯度洗脱样品均可使用。

高效液相色谱常用的检测器是紫外检测器。在日常使用中，紫外检测仪主要需要注意检测池和氘灯的使用和维护。

测试池:长期使用测试池可能会造成污染。如果仪器参考能量正常，测得能量较低，可能是测试池污染造成的，可以清洗测试池。

清洗检测池部件，一般用1: 4左右的硝酸溶液超声波清洗，分别用纯水和甲醇溶液清洗，然后将检测池体重新组装推入池腔，拧紧池板螺丝。组装期间，池玻璃和垫圈必须对齐，以避免压碎池玻璃并导致检测池泄漏。

氘灯:氘灯正常使用寿命可达1500小时以上。灯的使用寿命与探测器的使用时间和开启频率有关。因此，应节省不必要的开启时间并降低开关频率，以延长氘灯的使用寿命。

如果准确判断氘灯无法点亮或能量过低，则需要更换新的氘灯。购买氘灯时，应咨询检查氘灯型号是否与仪器型号相符。更换氘灯时，请参考仪器手册中的相关内容，特别要注意氘灯连接线的位置顺序。

5.数据处理系统

该系统能够对测试数据进行采集、存储、显示、打印和处理，以便正确地进行样品分离、制备或鉴定。

六、色谱的常用基本术语

1.色谱图(色谱图am):色谱柱流出液通过检测器系统时产生的响应信号对时间或流动相流出量，或通过适当方法观察的纸色谱或薄层色谱的斑点和条带分布的图。

2.(色谱峰):流出色谱柱的组分通过检测器系统时产生的响应信号的微分曲线。

3.峰底:连接峰的起点和终点的直线(图1中的CD)。

4.峰高(h，峰高):从峰顶到峰底的距离(见图1)。

5.峰宽(W，峰宽):峰两侧拐点处的切线与峰底部两点的交点之间的距离。

6.W h/2(半高时的峰宽):通过峰高的中点画一条平行于峰底的直线，此直线与峰两侧两个交点的距离(图1中的HJ)。

7.峰面积(a):峰和峰底之间的面积。

8.拖尾峰:一个不对称的峰，其后缘比前缘平缓。

9.前缘峰:一个不对称的峰，具有平缓的前缘和平缓的后缘。(又称伸舌峰和前伸峰)

10.鬼峰:除正常组分产生的色谱峰外，因仪器条件变化而出现在光谱上的色谱峰，即不是样品产生的峰。这种色谱峰不代表某一特定组分，容易给定性定量分析带来误差。(又名鬼峰)

11.分散峰:形状不对称的色谱峰，如前伸峰和拖尾峰。

12.负峰:也叫倒峰、负峰，即峰方向与通常方向相反的色谱峰。

13.原点:样品滴在纸上或薄层板上的部位的中心点。

14.斑点:在平面色谱中，展开和展开光谱后，组分显示出近似圆形或椭圆形的颜色区域(图2)。

15.区域:色谱柱、纸或薄层板上被分离组分所占的面积。

16.多斑点:一种成分形成两个或多个清晰的斑点。

17.区域拖尾:由于物理和化学的影响，组件展开后形成的彗星状斑点。

18.基线:在正常操作条件下，只有流动相通过检测器系统时产生的响应信号曲线。

19.基线漂移:基线随时间方向的缓慢变化。

20.基线噪声(n):各种原因引起的基线波动。

七。应用领域

环境:常见的无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害重金属及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分。

农业:土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中的无机和有机成分。

石油:石油中的烃族组成和微量成分。

化学工业:无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂配料、化妆品、染料。

材料:液晶材料、合成高分子材料。

食品:无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、真菌毒素、多核芳香烃。

生物:氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物。

医药:人体化学成分，各种合成药物，各种天然动植物药物。

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